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G5U 超保真DNA聚合酶——DNA聚合酶的金标准！

(2023-9-18)

         G5U High-Fidelity DNA Polymerase，由HaiGene分子酶进化平台（in silico Design & invitro Evolution Workflow）筛选获得。该酶来源于高保真DNA聚合酶，并加入了增强的延伸结构，使其具有长片段扩增、高产能力。强压力筛选的外切活性区域（100xTaq酶保真度），使其具有超保真性能。底物活性中心的改造，使其具有dUTP渗入的能力、扩增含有尿嘧啶模板的能力。使用该酶可轻松扩增8kb的基因组DNA、20kb的λDNA。该酶具有2kb/min以上的延伸速度。该酶具有强3’-5’的外切酶活性，产物为平末端。
         许多有高保真功能的聚合酶来源为 B型 DNA 聚合酶，在遇到 DNA 模板中的尿嘧啶碱基时停止复制。 G5U删除了尿嘧啶结合域，使其能够读取和扩增含有尿嘧啶的模板，该性能赋予其独特的“U” 特征。该特征有两个重要的应用方向：（1）用于超保真扩增重亚硫酸氢盐转化、脱氨基、或受损DNA；（2）在超保真扩增中搭配dUTP和热敏UDG，用于防止PCR体系中携带污染。除此外，也多用于USER 克隆。
特征
  • 超保真扩增：与Q5同水平的保真性能（100xTaq酶保真度）。
  • 识别dUTP底物：能够读取和扩增含有尿嘧啶的模板，具有“U” 特征。
  • 防污染扩增：在PCR扩增中可用dUTP完全替代dTTP，建立防污染高保真扩增。
  • 长片段扩增：质粒、λDNA 等简单模板>20 kb，复杂基因组模板>8 kb。
功能测试
（该实验结果来自HaiGene实验室，未经允许，不得转载）

1.不同长度片段的扩增图（最高到20kb）: 使用G5U HiFi DNA Polymerase以gDNA为模板进行扩增500bp-8kb的产物，以λDNA为模板扩增15-20kb的产物。酶的使用浓度为：0.02-0.04U/μl。

G5U超保真DNA聚合酶

2. 扩增dUTP能力测试：G重硫酸盐处理DNA后，未发生甲基化的C碱基转化为U碱基，使用G5U HiFi DNA Polymerase用于高保真扩增DNA甲基化实验，扩增产物为500bp，酶的工作浓度为0.04U/μl。

G5U超保真DNA聚合酶

3.不同酶量扩增效果：以gDNA为模板（2ng/μl）分别使用不同量的G5U扩增5kb的片段，如图所示在0.02U/μl的酶浓度下即可有效扩增。

G5U超保真DNA聚合酶

4. 扩增灵敏度展示：使用G5U HiFi DNA Polymerase以不同量的gDNA为模板扩增500bp的产物，如图所示该酶可扩增低至10pg的gDNA（约3-5个细胞），酶工作浓度为0.04U/μl。

G5U超保真DNA聚合酶

5. 保真度扩增实验：使用含不同保真度的DNA聚合酶的PCR Mix对DNA模板进行扩增35cycles后，进行NGS测序。结果表明：G5U HiFi DNA聚合酶具有最高的保真度，约是taq酶的105倍。

G5U超保真DNA聚合酶